光スイッチングラマンプローブによる超解像イメージング 生体内の複雑かつ微細な構造を観察する手法を開拓

東京工業大学 生命理工学院 生命理工学系の神谷真子教授ら、東京大学 先端科学技術研究センターの小関泰之教授（研究当時：同大学 大学院工学系研究科 電気系工学専攻）と同大学 大学院工学系研究科 電気系工学専攻の寿景文大学院生（研究当時）、薬学系研究科の駒沢歩弥大学院生（研究当時）ら、工学系研究科 電気系工学専攻の三田吉郎教授と安永竣助教（研究当時：特任研究員）らの研究チームは、光スイッチングの可能なラマンプローブ^[用語1]による超解像イメージング^[用語2]に成功しました。

光を用いて試料の分子振動を検出するラマン顕微法^[用語3]は、蛍光法と比べて多重検出能に優れており、一度に複数の標的を可視化できるイメージング手法として注目を集めています。しかし、その空間分解能は回折限界（光の波長程度）に制限されており、生体内の微細構造を観察する上での障壁となっていました。

本研究では、光でラマン信号を制御可能な光スイッチングラマンプローブを用いることで、ラマン顕微法による超解像イメージングを実現しました（図1）。まず、信号強度の高い光スイッチングラマンプローブDAE620を開発し、この分子に微弱な紫外線あるいは可視光を照射することでラマン信号をON/OFFできること、また、この光スイッチング動作は細胞中やショウジョウバエ組織中でも可能であることを確認しました。さらに、この分子で細胞小器官を染色し、紫外光と可視光ドーナツビームを照射しながら誘導ラマン散乱（SRS）顕微法^[用語4]によるイメージングを行うことで、回折限界を越える空間分解能を実現できることを実証しました。今後、光スイッチングラマンプローブを多色化し、超多色・超解像イメージングを実現することができれば、生体内の複数種の構成要素の微細構造を観察することが可能となり、生命や病気の仕組みの解明などにつながることが期待されます。

本研究成果は、米国東部夏時間6月16日付の「Science Advances」に掲載されました。

生体内ではさまざまな微細構造を有する生体分子や小器官などが複雑に相互作用し、生命活動を維持していると考えられており、その観察技術の開発が求められています。超解像顕微鏡は、光学顕微鏡の回折限界を克服し、ナノメートルスケールの空間分解能で生体内の細胞内構造を観察することを実現しました。近年では多色超解像蛍光イメージング技術が開発されていますが、蛍光は波長帯域が広いため、分離検出可能な色数が制限されます。一方、分子振動を反映するラマン散乱は、蛍光よりも50倍程度狭い線幅を持つスペクトル特性を有し、多重検出能に優れます。ラマン散乱を検出するラマン顕微鏡を用いて超解像イメージングを実現できれば、超多色・超解像イメージングの実現に有利と考えられます。しかし、従来の超解像ラマン顕微法では高強度光の照射を必要とすることから、試料の光損傷といった問題や、複雑な光制御を必要とするなどの課題がありました。

本研究では、光スイッチングラマンプローブを用いる新しい超解像イメージング手法であるRESORT（REversible Saturable Optical Raman Transition）法を開発しました。本手法では、高速ラマンイメージング法として知られるSRS顕微法において、微弱な紫外光と可視ドーナツビームを導入することで超解像イメージングを実現します。RESORT法の実証のために、高いSRS信号強度を有し、光照射でラマン信号をON/OFFできる新しい光スイッチングラマンプローブDAE620を開発し、その優れた光スイッチング特性を確認しました。さらに、細胞中のミトコンドリアを染色可能なDAE620-mitoを合成し、ミトコンドリアの超解像イメージングを行いました。図1に示すように、SRSイメージングでは分解できなかった構造をRESORTイメージングで分離して観察することに成功しました。空間分解能は150 nm程度と見積もられます。さらに、テスト試料を用いて空間分解能を検証したところ、可視ドーナツビームの強度を高めるとともに空間分解能が100 nm程度まで向上できることがわかりました。

通常のSRS画像（Normal）では分解できなかった構造がRESORTイメージングでは分解されて観察される。

今後、光スイッチングラマンプローブの多色展開を行い、超多色RESORT法を実現することができれば、超多色・超解像イメージングが実現し、従来手法では観察の難しかった複雑かつ微細な生体内の構造を明らかにすることができ、生命の仕組みや疾病の機構の解明などにつながる新しい知見につながることが期待されます。