がんの光温熱療法に適した金ナノ粒子を、ペプチドを用いて簡便に合成 常温・常圧で、環境負荷を抑えながら、生体適合性の高い三角金ナノプレートを合成

東京工業大学 物質理工学院 応用化学系の田中祐圭助教、大河内美奈教授、大学院生の林美伶、桐木友花、同大学 科学技術創成研究院 化学生命科学研究所の野本貴大助教、西山伸宏教授、生命理工学院 生命理工学系の門之園哲哉助教との異分野融合共同研究グループは、英国Leeds大学、韓国Chung-Ang大学との国際共同研究を通じて、金イオンと特定のペプチド^[用語1]を混ぜるだけで、がん光温熱療法^[用語2]に適した形状の金ナノ粒子^[用語3]である三角金ナノプレートを合成できる新しい方法を開発した。

金をナノメートル（10億分の1メートル）単位まで小さくした金ナノ粒子は、その安定性の高さと毒性の低さによって、医療分野で高い注目を集めている。ただし実用化にあたっては、その安全性を高め、十分な効果を引き出すため、目的に応じて粒子の形やサイズを最適化する必要性があった。

三角形をした薄いプレート状の金ナノ粒子である三角金ナノプレートは、生体を透過しやすい近赤外光^[用語4]を吸収することによって発熱の効果が得られるため、患部以外の生体部分へ余分な負担を掛けることなく、がんの光温熱療法へ利用できる可能性が高いと期待を寄せられている。しかし、三角金ナノプレートの合成は従来、細胞毒性の高い界面活性剤や還元剤を用いて行われていたため、そのままでは生体に用いることは難しく、生体毒性のない原料による粒子合成技術の開発が求められていた。

本研究グループでは、これまで「ASHQWAWKWE（A：アラニン、S：セリン、H：ヒスチジン、Q：グルタミン、W：トリプトファン、K：リジン、E：グルタミン酸）」というアミノ酸配列^[用語5]をもったペプチドを用いて、高温・高圧環境での操作や細胞毒性の強い反応剤を必要とせずに、同ペプチドと金イオンを室温で混合するだけで金ナノ粒子が合成できる手法を開発している。

今回は粒子合成を行う際、このASHQWAWKWEのアミノ酸配列をもつペプチドの濃度を変更するだけで粒子サイズを制御し、さらにこのアミノ酸配列の一部を置換することによって、円形度の調整も施した三角金ナノプレートを合成した。合成によって得られた粒子は生体適合性が非常に高く、近赤外光を照射することでがん細胞を死滅させることができた。

室温で中性に近いpHという環境のもと、混ぜるだけで三角金ナノプレートを合成できる本研究は、環境調和型の機能性金ナノ粒子合成技術として、バイオメディカル分野においてさまざまな形での応用が期待される。

この研究成果は6月15日付で、生体材料科学の国際誌「ACTA Biomaterialia」に掲載された。

金属や半導体などのナノ粒子は、それぞれ独自の有用な特性を持ち、工業用素材や触媒などとして幅広い分野で活用されている。特に金ナノ粒子は、優れた安定性や生体適合性から多くの分野で注目されており、バイオメディカル分野からの関心も高い。

その応用可能性の一つとして期待を集めているのが、金ナノ粒子に近赤外光を照射し、粒子上に発生した熱によってがん細胞を死滅させるがんの光温熱療法である。金ナノ粒子の物性はサイズ、形状によって変化するため、これまでにさまざまな形状の金ナノ粒子が合成されており、なかでも棒状の金ナノロッド、とげ状の構造をもつ金ナノスター、そして平らなプレート状の金ナノプレートなどが近赤外光を吸収する材料として知られている。

ただし、このような形態に制御された金ナノ粒子の合成は、一般的に、細胞毒性の高いヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（Hexadecyltrimethylammonium chloride／CTAC）などの界面活性剤や、水素化ホウ素ナトリウム（NaBH₄）などの強い還元剤を使用し、高温・高圧で行われているため実際の利用は難しく、人体に影響の少ない原料によって、より環境に負荷のかからない条件で行える粒子合成技術の開発が求められていた。

本研究グループではこれまでに、ASHQWAWKWEのアミノ酸配列を持つ「B3」と呼ばれるペプチドを発見し、金イオンと混ぜることによって、細胞毒性の高い界面活性剤や強い還元剤などを使わず、高温・高圧での操作も必要とせずに、室温・常圧、中性溶液中で金ナノ粒子を製造する方法を開発している（Tanaka M. et al., Nanoscale Adv., 48(8):978-981(2019), Tanaka M. et al., Acta Biomater., 49:495-506(2017)）。今回はこのB3ペプチドを用いて、近赤外光を吸収し、金ナノロッドや金ナノスターより細胞への取り込み活性が高いとされる三角金ナノプレートの合成条件を検討した。

本研究では、B3ペプチドと金イオンの混和によって合成される金ナノ粒子が、どのような条件のもとで三角金ナノプレートの形状を取るのかを明らかにするため、（1）使用するB3ペプチドの濃度をさまざまに変えながら金イオンと混和し、各濃度のペプチドによって合成された金ナノ粒子の形状を調べ、三角金ナノプレートの形成に適したペプチドの濃度を確認した。さらに、（2）詳細な形状制御の条件を明らかにするため、B3ペプチドのアミノ酸配列の一部を置換した改変ペプチドを使い、三角金ナノプレートの形態、特に円形度の変化を確認した。

また、合成された三角金ナノプレートのがん光温熱療法への応用を見据え、（3）ペプチドを使って合成された三角金ナノプレートについての生体適合性の評価と、（4）光温熱療法を試みた場合のがん細胞に対する効果の評価を実施した。

その結果、ペプチド濃度0.14～0.30 mM^[用語6]の範囲で合成することで三角金ナノプレートが合成できることと、B3ペプチドのアミノ酸配列（ASHQWAWKWE）の3番目に位置するヒスチジンが三角金ナノプレートの円形度の調整に大きな役割を果たしていることが示された。あわせて、B3ペプチドによって合成される金ナノ粒子が優れた生体適合性を示し、近赤外光の照射によってがんを死滅させることも確認され、がん細胞の光温熱療法に利用できる三角金ナノプレートを、ペプチドと金イオンを室温かつ中性に近いpHで混和するだけで合成できることが確認された。

まずはB3ペプチド（アミノ酸配列：ASHQWAWKWE）の濃度をさまざまに変えながら金イオンと混和し、近赤外光を吸収する三角金ナノプレートの合成に適したペプチドの濃度を検討した。

具体的には、pH7.4のトリス緩衝生理食塩水（Tris-buffered saline）に溶解させる形で、金の化合物である四塩化金酸（HAuCl₄）0.5 mMと、それぞれ濃度を変えたB3ペプチドを室温で混和し、静置することで金ナノ粒子を合成した。

合成された粒子について、紫外可視分光（UV-Vis）スペクトルと透過型電子顕微鏡観察による評価を行ったところ、540 nm近傍の光を吸収する正十面体と、650 nm以上の近赤外光を吸収する三角ナノプレートの2種類が合成されることが示された。それぞれの粒子は、結晶の格子中における結晶面を示すミラー指数で表記すると主に{111}面^[用語7]を有することから、このB3ペプチドはこの{111}面という結晶面をもつ粒子の形態制御に寄与することが示唆された。さらに、ペプチド濃度0.18～0.30 mMの範囲で合成することにより、ペプチド濃度を薄くするにつれて粒径が大きく、さらに吸収する波長がより長い三角金ナノプレートを合成できることが示された（図1、表1）。

*溶液中に見られる全粒子における三角金ナノプレートの割合

次に、B3ペプチド（アミノ酸配列：ASHQWAWKWE／A：アラニン、S：セリン、H：ヒスチジン、Q：グルタミン、W：トリプトファン、K：リジン、E：グルタミン酸）を構成する10連のアミノ酸のうち、どの部分が形状制御への影響が大きいのかを確認するため、アミノ酸の一部を置換した改変ペプチドによる粒子合成を検討した。

まずB3ペプチドのうち、金属イオンと結合することが知られる3番目にあるヒスチジン（H）、塩基性アミノ酸である8番目のリジン（K）、酸性アミノ酸である10番目のグルタミン酸（E）に着目し、これらのアミノ酸を、それぞれ中性アミノ酸であるアラニン（A）に置換した改変ペプチド3種（H3A、 K8A、 E10A）を用いて金ナノ粒子を合成した。

その結果、合成された粒子が示す紫外可視分光（UV-Vis）スペクトルの結果から、3番目のヒスチジン（H）を置換したH3Aと、8番目のリジン（K）を置換したK8Aで合成した粒子が、オリジナルのB3ペプチドで合成した粒子とは異なるスペクトルを示すことが示された（図2）。そのため、この3番目のヒスチジンと8番目のリジンが金ナノ粒子の形態制御に重要であることが示唆された。一方で、リジン（K）を置換したK8Aにより合成された粒子は分散性が著しく低下したため、評価が困難であり応用に向けても不利であると判断されたことから、ヒスチジン（H）を置換したH3Aペプチドについてより詳細に検討を進めた。

図2.

B3改変ペプチドにより合成された金ナノ粒子の紫外可視分光（UV-Vis）スペクトルと透過型電子顕微鏡による画像（Scale bar:100 nm）

先の改変では、B3ペプチド（アミノ酸配列：ASHQWAWKWE）の3番目にあるヒスチジン（H）をアラニン（A）に変更したが、今度はヒスチジンが重要な役割を果たしているかについて、より入念な検討を行うため、このヒスチジン（H）を、酸性アミノ酸であるグルタミン酸（E）、芳香族アミノ酸であるトリプトファン（W）、塩基性アミノ酸であるリジン（K）に改変した3通りのペプチド（H3E、 H3W、 H3K）を用意して金ナノ粒子を合成した。その結果、各改変ペプチドによって合成された粒子はそれぞれ異なる紫外可視分光（UV-Vis）スペクトルを示すことが確認された。そこで、透過型電子顕微鏡を用いて、合成された粒子の画像を観察したところ、非常に興味深いことに、改変されたペプチドの配列の違いによって、合成される三角金ナノプレートの「円形度」が変化することが確認された（図2、表2）。以上より、B3ペプチドの3番目に位置するヒスチジンが、このペプチドにより合成される三角金ナノプレートの「円形度」の制御に重要な役割を果たしていることが示された。

*もとのB3ペプチドから改変されたアミノ酸はアンダーラインで表記

次に、B3ペプチドによって合成される三角金ナノプレートの生体適合性を評価するため、合成された三角金ナノプレートを含む金ナノ粒子とヒト皮膚線維芽（NHDF）細胞株を混合し、24時間後の生細胞の割合を確認した。対照として、一般的な金ナノ粒子の合成に用いられる界面活性剤である、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（CTAC）によって被覆された金ナノロッドとヒト皮膚線維芽を混合した場合の生細胞の割合もあわせて確認した。

その結果、B3ペプチドによって合成された金ナノ粒子では、80 µg/ml（金元素濃度）を混合した場合においてもほぼすべての細胞が生育していたのに対して、一般に広く研究が進められているCTAC被覆ナノロッドでは10 µg/mlの混合でも、ほぼすべての細胞が死滅することが確認された（図3）。以上の結果より、B3によって合成される三角金ナノプレートが優れた生体適合性を示すことが確認された。

最後に、B3ペプチドによって合成された三角金ナノプレートを用い、がん細胞に対する近赤外光照射による光温熱療法の評価を実施した。合成された三角金ナノプレートをヒト子宮頸がん（Hela）細胞株を培養した培養液に添加し、近赤外光を1.8 W/cm²で5分間照射した。その結果、三角金ナノプレートを加えたサンプルでのみ細胞が死滅することが確認された（図4）。これによりB3ペプチドにより合成される三角金ナノプレートが、がん細胞の光温熱療法に利用できる可能性が示唆された。

左は近赤外光の照射無し、右は照射有り、上は三角金ナノプレートあり、下は三角金ナノプレートなし。緑：Calcein-AMで染色した生細胞、赤：Propidium iodideで染色した死細胞。

本研究により、がん細胞の光温熱療法に利用できる三角金ナノプレートを室温、中性に近いpHという条件において、生体分子であるペプチドと金イオンを混和するだけで合成できることが確認された。この環境調和型の合成法で得られる粒子は生体適合性が高いことが示されたことから、バイオメディカル分野での利用が広く期待される。今後は、ペプチドにより合成される金ナノ粒子の形態制御機構の詳細な研究を進めることによって、さらに多様な形態の粒子が合成可能となり、また、目的の形態やサイズの金ナノ粒子の合成効率も向上できるものと予測している。これらにより、バイオメディカル分野を含め、さまざまな用途に応じて、最適な形状と特性をもった金ナノ粒子を、環境に負荷のかからない条件で合成できる技術の確立を目指していく。