多剤排出トランスポーターの薬剤排出機構を解明

スーパーコンピュータ「京」で巨大分子機械の動きを計算

要旨

理化学研究所（理研） 計算科学研究機構 粒子系生物物理研究チームの松永康佑研究員（JSTさきがけ研究員）、横浜市立大学 大学院の山根努特任助教、池口満徳教授、木寺詔紀教授、東京工業大学の村上聡教授らの共同研究グループ^※は、社会問題となっている多剤耐性細菌の原因の1つとされる多剤排出トランスポーター^[用語1]「AcrB」の薬剤排出機構を、スーパーコンピュータ「京」^[用語2]を用いたシミュレーションによって解明しました。

病原菌やがん細胞に対して薬が作用しなくなる「薬剤耐性化」は、現代の医療現場で大きな問題となっています。特に、院内感染を起こす緑膿菌などの薬剤耐性化は、細菌の膜に存在する多剤排出トランスポーターと呼ばれるタンパク質が薬剤を細胞外へ排出することが主な原因と考えられています。そのため、多剤排出トランスポーターの薬剤排出機構の解明が課題となっています。大腸菌由来の多剤排出トランスポーターであるAcrBは、村上教授らが2002年および2006年にX線結晶構造解析^[用語3]によって構造を解明し、それに基づいた作動原理として「機能的回転機構^[用語4]」仮説を提唱しました^[注1]）。2010年には、この仮説は京都大学の高田彰二教授らによる粗視化シミュレーション技法^[用語5]などによって実証されました^[注2]。しかし、膜を介したプロトン（水素イオン）移動によってどのようにAcrBの構造変化が起き、機能的回転が起るのか、その動的な機構は分かっていませんでした。

今回、共同研究グループは、AcrBとその周りの膜や水分子を「丸ごと」模した全原子モデルを計算機上で再現し、「京」の高並列性を生かすアルゴリズムを用いて薬剤排出過程を計算しました。その結果、AcrBの膜内にあるアスパラギン酸にプロトンが結合すると、薬剤排出へつながる構造変化が引き起こされること、また50オングストローム（Å、1Åは100億分の1メートル）も離れた薬剤排出部位の構造変化へ至る過程を明らかにしました。

本成果は、排出を阻害する薬剤開発の基礎に貢献するとともに、生体分子で見られる化学エネルギー・力学エネルギー変換機構の一例を提供するものです。

本研究は、英国のオンライン科学雑誌「eLife」（3月6日付け）に掲載されました。

本研究の一部は、文部科学省「次世代生命体統合シミュレーションソフトウエアの研究開発」プロジェクトによる支援を受けました。また、本研究はHPCI「京」一般利用課題「最小自由エネルギー経路探索法による多剤排出トランスポーターの薬剤排出機構の解明（課題番号：hp120027）」、ポスト「京」重点課題1研究開発枠（課題番号：hp150269、hp160223、hp170255）として「京」の計算資源を用いて実施しました。

• 理化学研究所 計算科学研究機構 粒子系生物物理研究チーム

  研究員 松永康佑

• 横浜市立大学 大学院生命医科学研究科

  特任助教 山根努

  特任准教授 森次圭

  教授 池口満徳

  教授 木寺詔紀

• 東京工業大学 生命理工学院

  教授 村上聡

• 東京大学 大学院農学生命科学研究科

  特任准教授 寺田透

• 日本医科大学 物理学教室

  准教授 藤崎弘士

背景

効くはずの薬が効かなくなるという「薬剤耐性化」の問題は、現代の医療現場で大きな問題となっています。病原菌やがん細胞がこのような薬剤耐性を持つメカニズムはいくつかありますが、細胞膜に埋まっている多剤排出トランスポーターと呼ばれるタンパク質が原因の1つであることが分かっています。このタンパク質は巨大な分子機械で、抗生物質や毒物などの異物を取り込んでは細胞外に排出します。これにより、病原菌などに作用するはずの薬剤が効かなくなる現象が起こります。特に、院内感染で社会問題となっている緑膿菌などの薬剤耐性化は、RND型^[用語6]と呼ばれる多剤排出トランスポーターが主な要因になっています。

RND型の多剤排出トランスポーターは、細胞膜内外の酸性度（pH）の違いによりプロトン（水素イオン）が移動することを利用して薬剤を排出します。大腸菌由来のRND型多剤排出トランスポーター「AcrB」の構造は、2002年および2006年に村上教授らがX線結晶構造解析によって解明しました。AcrBは約1,000個のアミノ酸からなる巨大な分子が3つ集合した3量体で、3つの分子はそれぞれ異なる構造をとり、取込状態→結合状態→排出状態と順に構造変化して薬剤を排出していると考え、「機能的回転機構」仮説を提唱しました。

AcrBの構造で興味深いことは、薬剤排出に関わっている部位が、細胞膜内のプロトン結合部位と約50オングストローム（Å、1Åは100億分の1メートル）も離れている点です。プロトン移動という非常に小さな動きが、どのように増幅されて機能的回転につながる大きな構造変化と関わっているのか、機能的回転やプロトンを実験で観測することは難しく、その詳細は未解明でした（図1）。

2010年に京都大学の高田彰二教授らは、AcrBを構成する原子を粗視化したモデルのシミュレーションを行って、機能的回転機構仮説を実証しました。その粗視化モデルでは、プロトン移動による駆動力を抽象的に扱い、機能的回転が起こると薬剤を排出することを示しました。さらに2013年には、山根特任助教と池口教授らが、AcrBの全原子モデルのシミュレーションを行い、プロトン移動の際に膜内のどこの部位にプロトンが一時的に結合するのかを解明しました。プロトンをいくつかのアミノ酸に結合させ、シミュレーションを多数行うことで、排出型分子の膜内のアスパラギン酸（Asp408）というアミノ酸にプロトンが結合していると安定であることを示しました^[注3]。

しかし、Asp408にプロトンが一時的に結合・解離することが、どのように機能的回転へとつながる構造変化を引き起こすのかは解明されていません。プロトンと他の原子の相互作用を観察するには、全原子モデルを使う必要がありますが、機能的回転はおよそミリ秒（1,000分の1秒）で起こる非常に遅いプロセスのため、全原子モデルでシミュレーションすることは困難でした。そこで、共同研究グループはスーパーコンピュータ「京」とその高並列性を生かすアルゴリズムを用いて、解明に取り組みました。

研究手法と成果

共同研究グループは、AcrB 3量体の全原子モデル（周りの水分子や脂質、薬剤を全て含めて約50万原子系）について、「京」を用いて機能的回転へとつながる構造変化を分子動力学法^[用語7]でシミュレーションしました。分子動力学法では、1フェムト秒（1,000兆分の1秒）の1ステップごとに各原子に働く力を計算する必要があります。機能的回転は約1ミリ秒（1,000分の1秒）で起こるので、シミュレーションするには1兆回もの計算が必要となります。これを達成するには、例え1ステップを実時間で1ミリ秒で計算したとしても、数十年かかってしまいます。

そこで、計算を時間方向に分割するストリング法^[用語8]というアルゴリズムを組み合わせました。ストリング法では、1つの系をシミュレーションする代わりに、構造変化の経路を表した複数の系の分子動力学計算をまとめて行い、最も起こりやすい構造変化経路を探します。複数の系をまとめてシミュレーションするため、「京」の高並列環境があって初めて可能となった計算です（図2）。

ストリング法を使ったシミュレーションの結果、AcrB 3量体の内で結合状態にある分子のAsp408にプロトンが結合すると、機能的回転へとつながる構造変化が引き起こされることが分かりました。実際、構造変化経路に沿ったエネルギー変化を計算すると、結合状態が不安定化する一方で、排出状態が安定化することが示されました。対照実験として、排出状態にある分子のAsp408にプロトンを結合させて計算すると、排出状態が安定化したままで機能的回転は誘起されませんでした。

また、得られた構造変化経路を解析することで、離れた部位が連携して動いていることが明らかになりました。まず、膜に埋まっているAsp408の周りで何が起こっているのかを構造解析したところ、プロトン結合により膜に埋まっている部位で特定のαヘリックス^[用語9]が下がる運動が生じていることが分かりました。興味深いことに、この下がる運動はプロトン供給源である水分子の出入りを制御しており、結合状態においてプロトンの取り込み、排出状態においてプロトンの放出を起こしやすくしていました。これは結合状態においてプロトンが結合し機能的回転を起こすという結果とつじつまが合います。

さらに、膜に埋まっている部位と薬剤排出部位の動きの網羅的な相関解析を行ったところ、プロトン結合から薬剤排出へと至る相互作用の連鎖が明らかになりました。具体的には、αヘリックスが下がる運動が、膜に埋まっている部位と薬剤排出部位をつなぐ部位のコイル・ヘリックス転移^[用語10]を制御しており、その転移が薬剤排出部位の大規模な構造変化を引き起こしていました（図3）。

今後の期待

本成果は、多くの生体分子にみられるプロトン結合による化学エネルギーと薬剤輸送という力学的エネルギーの間の変換という基礎的問題に対して、1つの機構を提供します。それと同時に、多剤排出トランスポーターによって排出されない薬剤や、排出を阻害する薬剤の開発に資すると期待できます。

また、「京」などのスーパーコンピュータを用いた高性能計算により、実験では観察することが難しい分子機械の動く様子を明らかにできることを示しています。今後、ポスト「京」^[用語11]により網羅的な計算が可能になると、さまざまな薬剤の排出過程を観測して、排出される薬剤とされない薬剤の違いを解明したり、AcrBと結合するAcrZなどの他のタンパク質の影響を明らかにできると期待されます。

• プレスリリース 多剤排出トランスポーターの薬剤排出機構を解明 －スーパーコンピュータ「京」で巨大分子機械の動きを計算－
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