SARS-CoV-2の転写開始の鍵となるRNA構造を同定 汎コロナウイルス創薬の新規ターゲット開発に期待

東京工業大学 生命理工学院 生命理工学系の石井佳誉教授（理化学研究所（理研）生命機能科学研究センター先端NMR開発・応用研究チーム チームリーダー）、理研 生命機能科学研究センター先端NMR開発・応用研究チームの大山貴子研究員らの研究チームは、SARS-CoV-2のゲノム転写開始に関与する3′非翻訳領域^[用語1]で実験的には存在が確認されていなかったユニークなRNA構造^[用語2]が形成可能であることを示しました。

本研究成果は、ヒトやその他の動物のコロナウイルス感染症の予防薬や、感染後に症状を軽いものにとどめる薬の開発に貢献すると期待できます。

SARS-CoV-2やMERS^[用語3]を含むベーターコロナウイルス^[用語3a]のRNAゲノムには、タンパク質の遺伝情報を持たない非翻訳領域と呼ばれる部位が存在しています。この部位は、特定のRNA構造を形成して、RNAポリメラーゼ^[用語4]などのタンパク質との結合の制御に関与していることが知られています。コロナウイルスの3′側の非翻訳領域は2種類の構造を形成し、構造がスイッチすることでRNAの複製が開始すると考えられている領域があります。

研究チームは今回、2種類のRNA構造のうち、実験的に存在が確認されていなかったシュードノット構造^[用語5]といわれる特徴的な構造が形成可能であることを確認し、高磁場NMR^[用語6]を用いて原子レベルでその2次構造を同定しました。

本研究は、科学雑誌『JACS au』オンライン版（3月20日付）に掲載されました。

COVID-19の原因ウイルスであるSARS-CoV-2は、1本鎖RNAのゲノムを持っています。このRNAゲノムの両端には、タンパク質の情報を持たない非翻訳領域と呼ばれる配列が存在します。非翻訳領域はRNAウイルスのゲノムだけでなく、一般的な生物のmRNAにも見られます。非翻訳領域はタンパク質の情報を持ちませんが、RNA構造の形成に必要な配列を含んでおり、転写、翻訳、エピジェネティック制御^[用語7]などの生体中で起こるさまざまな反応に関与していることが近年明らかになりつつあります。

SARS-CoV-2を含むベータコロナウイルス属の3′側の非翻訳領域には、ウイルスゲノムの転写開始に必須である3′PKと呼ばれる領域があります。この領域は、極めて遺伝的変異が少なく、この領域のRNA構造が失われるとウイルスが複製不能になります。3′PKは特定の2種類のRNA構造を形成することで、RNA依存RNAポリメラーゼ（RdRp）^[用語4a]のゲノムRNAへの結合を制御していると考えられています。具体的には、このRNA領域はステムループ構造^[用語8]をとっており、①そこにRdRpの補助因子（コファクターと呼ばれるタンパク質複合体）がまず結合してRNA転写の準備をします（図1－①）。そうすると、②RNAがシュードノット構造にスイッチし（図1－②）、③そこにRdRpの本体が結合する（図1－③）ことでRdRpが完成するという仮説が提案されています。

これまでの研究で、①のステムループ構造は形成可能であることが示されています。しかし、RNA複製の鍵になる②のシュードノット構造は、過去の研究から形成が予測されていましたが、実験的にその存在が確認されていませんでした。シュードノット構造はRdRpの構成タンパク質の一部と結合した時に形成されると考えられている構造です。言い換えると、通常はステムループ構造がシュードノット構造よりも安定で、RNA複製の準備ができた特別な条件でのみシュードノット構造がステムループ構造よりも安定化すると考えられます。研究チームは、高磁場NMRを用いて3′PKのRNA構造形成を詳しく解析しました。

ベータコロナウイルス属のゲノム複製（RNAの転写）の模式図。ウイルスゲノムの転写開始に必須である3′側非翻訳領域の3′PK領域の2次構造を図示し、色分けした部分は塩基対を形成する配列の位置を示す。nsp7/nsp8はRNA依存RNAポリメラーゼ（RdRp）のコファクター。nsp12はRdRpの本体。①〜③の転写開始の仕組みについては本文を参照。

コロナウイルスのゲノムRNAは、そのままでは大きすぎてNMRでの構造解析ができません。そこで研究チームは、部分的に切り出したゲノムRNA配列の中からシュードノット構造を形成できる領域を注意深く探し、溶液も細胞中の条件に似せることで、シュードノット構造を安定な形で観測することを試みました。まず、SARS-CoV-2の3′PK領域と同じ配列を持つRNAを合成し、この合成RNAを細胞中と似た溶液条件下に置くことでシュードノット構造が形成されるかを高磁場NMRを用いて確かめました。NMRでは、RNAが塩基対を形成しているかどうかを10～14 ppm^[用語9]の領域に観測されるNMRシグナルの化学シフト^[用語6a]から判別することが可能で、これによりRNAの構造が判定できます。3′PK領域の全体を含むPKP4と名付けたRNAと、PKP4の一部が欠けているSLP4と名付けたRNAの2次構造を調べました。その結果、PKP4と名付けたRNAはシュードノット構造を、SLP4と名付けたRNAはステムループ構造を形成していることが分かりました。SLP4が形成するステムループ構造は他の研究グループが過去に報告したSARS-CoV-2の同じ領域の2次構造とよく似ていましたが、3′PK領域でのシュードノット構造の形成は本研究が初めての実験的な報告例となります。

次にシュードノット構造をとるPKP4が、RdRpのコファクターと結合するかを調べ、今まで提唱されていたウイルスゲノムの転写開始の仮説と同じ反応が起こり得るかを確かめました。もし形成が確認されたシュードノット構造のRNAがRdRpと結合すれば、RNAだけあるいはタンパク質だけの時とは異なるNMRシグナルが検出されます。実際に測定すると、シュードノット構造のRNA（PKP4）はRdRpのコファクターと結合することが分かりました（図2左）。同様の実験をステムループ構造RNA（SLP4）でも行ったところ、ステムループ構造もRdRpのコファクターと結合することが分かりました（図2右）。さらにRdRpのコファクターはステムループ構造かシュードノット構造かで異なる構造をしている可能性が判明しました。

以上の結果から、コロナウイルスのゲノムRNAのRdRpが完成するという図1に示したモデルの①と②の反応が起こり得ると実験的に初めて示されました。

SARS-CoV-2の3′PK領域とRdRpのコファクターが結合すると、それぞれの構造に変化が起こる。この構造変化により、NMRスペクトルでシグナルが元の位置とは異なる位置に観測される。
左）上から、シュードノット構造をとるPKP4、コファクター（nsp7/nsp8）、およびPKP4とコファクター混合溶液のNMRスペクトル。★は、PKP4とコファクターの混合溶液でのみ観察されたコファクターのスペクトルのピークを示す。
右）上から、ステムループ構造をとるSLP4、コファクター（nsp7/nsp8）、SLP4とコファクターの混合溶液のNMRスペクトル。PKP4とSLP4では混合溶液のスペクトルにおけるコファクターのシグナルが異なったことから、コファクターの立体構造は、結合相手のRNAがシュードノット構造かステムループ構造かで異なることが示唆された。

今回、SAS-CoV-2ゲノムRNAの3′側の非翻訳領域（3′PK領域）に形成が確認された2つのRNA構造は、RdRpのコファクターとの結合に関与することが示唆されました。従ってこの結合を阻害すれば、ウイルスゲノムの転写が開始できなくなり、ウイルス増殖を抑制することができると考えられます。この結合阻害は、今までの抗コロナウイルス薬のメカニズムとは異なった新しい抗コロナウイルス薬の創薬に応用できる可能性があります。また3′PK領域の配列はSAS-CoV-2ウイルス間でかなり変異が少ないものの、まれな変異が起こった場合でもRNA構造は保持したままであることが分かっており、このような変異株に対する創薬デザインにも役立つと考えられます。

本研究ではSAS-CoV-2を用いてRNAのシュードノット構造の形成を確認しましたが、同様のシュードノット構造はベータコロナウイルス属で共通に形成可能であることがRNA配列の比較から推測されます。このシュードノット構造は、COVID-19だけではなく、今後登場が予想されるコロナウイルスが原因の重篤な疾病や、ウシ、ブタ、ネコなどの動物に致死的なコロナウイルスが原因の疾病にも幅広く効果を示す「汎コロナウイルス薬剤」の開発につながる新たな創薬ターゲットとして期待できます。