柔軟なエピゲノムがクロマチン構造を維持する クロマチン構造の頑健性を保つバックアップシステム

東京工業大学 科学技術創成研究院 細胞制御工学研究センターの志見剛特任准教授（研究当時）、木村宏教授、理化学研究所（理研）開拓研究本部眞貝細胞記憶研究室の福田渓客員研究員、志村知古テクニカルスタッフI、眞貝洋一主任研究員らの共同研究グループは、高次クロマチン^[用語1a]構造の形成における抑制性クロマチン修飾^[用語2]の意義を多面的に明らかにしました。

本研究成果は、老化に伴う細胞機能の低下・不全にヘテロクロマチン^[用語1b]状態の変化が重要な役割を果たすとされる機構を理解する上で重要な知見です。

多細胞真核生物のゲノム情報は、転写活性化状態にあるユークロマチン^[用語1c]と転写抑制状態にあるヘテロクロマチンに分かれて核内に格納されています。体細胞におけるヘテロクロマチンの大部分は、ヒストン^[用語1d]H3の9番目のリジン（H3K9）のメチル化（特にトリメチル化）により覆われています。

今回、共同研究グループはH3K9メチル化を完全に欠損したマウス繊維芽細胞の確立に成功しました。H3K9メチル化を欠損するとエピゲノム^[用語3]状態がダイナミックに変化し、別の抑制性クロマチン修飾であるヒストンH3の27番目のリジン（H3K27）トリメチル化がヘテロクロマチンを覆い、ヘテロクロマチンの核内局在、凝集、転写抑制など、ヘテロクロマチン形成におけるH3K9メチル化の機能を代替することで、ヘテロクロマチンを維持することが分かりました。

本研究は、科学雑誌「Nucleic Acids Research」オンライン版（5月13日付）に掲載されました。

転写不活性で凝集したクロマチン構造であるヘテロクロマチンは約100年前に発見されました。近年のエピゲノム解析や高次クロマチン構造の解析技術の発展により、ヘテロクロマチンは核膜^[用語4]の近くに局在し、転写活性状態にあるユークロマチンから隔離されていることが明らかになってきました。ヘテロクロマチンは転写制御、ゲノム安定性、ゲノム複製などさまざまな核内現象に関わる重要な構造ですが、その形成機構の全貌はまだ明らかではありません。

ヘテロクロマチンの大部分は抑制性クロマチン修飾であるヒストンH3の9番目のリジン（H3K9）メチル化（特にトリメチル化）により覆われており、H3K9メチル化に結合するタンパク質HP1がクロマチンを凝縮させるため、H3K9メチル化がヘテロクロマチン形成に重要な働きを担っていると推測されていました。しかし、哺乳類においてH3K9メチル化酵素は5種類存在しており、それぞれが冗長的に機能するため、ヘテロクロマチン形成におけるH3K9メチル化の役割を調べるのは困難でした。

本研究では、5種類のH3K9メチル化酵素を全て欠損した細胞株を確立し、ヘテロクロマチン形成におけるH3K9メチル化の重要性を検証することを目指しました。

哺乳類は、SETDB1、SUV39H1、SUV39H2、EHMT1、EHMT2の5種類のH3K9メチル化酵素を持っています。福田客員研究員らは過去に、Setdb1、Suv39h1、Suv39h2の3つの遺伝子を欠損したマウス由来不死化線維芽細胞（3 knockouts immortalized mouse embryonic fibroblasts：3KO iMEFs）を樹立していました^{[参考文献1]}。

今回、共同研究グループはCRISPR-Cas9システム^[用語5]を用いることで、3KO iMEFsからさらにEhmt1とEhmt2を欠損した5KO iMEFsを作製することに成功しました。5KO iMEFsでは完全にH3K9メチル化が消失していましたが、細胞増殖能が維持されていたため、H3K9メチル化のない状態がクロマチン構造に与える影響を多面的に解析することが可能でした。

ヘテロクロマチンは、電子顕微鏡により電子密度の高い領域として確認することができます。5KO iMEFsのヘテロクロマチン状態を電子顕微鏡で解析すると、H3K9メチル化がないにもかかわらず、ヘテロクロマチンは維持されていました（図1右上）。5KO iMEFsにおけるエピゲノムを解析すると、別の抑制性クロマチン修飾であるヒストンH3の27番目のリジン（H3K27）トリメチル化が、ヘテロクロマチン全域を覆うように広がることが分かりました。H3K27トリメチル化はEZH1、EZH2という2種類の酵素で触媒されています。ヘテロクロマチン構造におけるH3K27トリメチル化の機能を調べるために、EZH1とEZH2の酵素活性阻害剤であるDS3201を野生型と5KO iMEFsに投与し、ヘテロクロマチン状態を解析しました。その結果、5KO iMEFsにDS3201を投与したサンプルでのみ、ヘテロクロマチンの消失が観察されました（図1右下）。

野生型細胞にEZH1/EZH2阻害剤DS3201を投与しても、矢印で示されるヘテロクロマチンは維持されているが（左下）、5KO細胞にDS3201を投与すると、一部の細胞でヘテロクロマチンの消失が観察される（右下）。DMSO（ジメチルスルホキシド）は溶媒コントロールとして用いている。

次に、Hi-C法^[用語6]とラミンChIP-seq法^[用語7]により、ゲノム配列レベルでヘテロクロマチンの構造と核内局在を解析しました。すると、電子顕微鏡の結果と一致して、ヘテロクロマチン同士の近接度合いや核膜近くへの局在は、H3K9メチル化とH3K27トリメチル化の双方を欠損して初めて大きな変動が観察されました（図2下段）。以上の結果から、H3K9メチル化がなくなるとH3K27トリメチル化がその分布をダイナミックに変化させ、ヘテロクロマチンの核内局在、凝集、転写抑制などH3K9メチル化の機能を代替し、ヘテロクロマチンを頑健に維持していることが明らかになりました。

上段）野生型では、核内のヘテロクロマチンはH3K9メチル化とH3K27トリメチル化に覆われており、クロマチン同士は近接し、核膜周辺に存在する。
中段）核内ヘテロクロマチンのH3K9メチル化を欠損させると、残ったH3K27トリメチル化の分布は変化するが、クロマチン同士の近接や核内局在は野生型と比べてあまり変化しない。
下段）H3K9メチル化とH3K27トリメチル化の双方を欠損すると、ヘテロクロマチン同士の近接が減少するとともに、核膜周辺からヘテロクロマチンが離れる。しかし、この状態でもヘテロクロマチン構造を維持するゲノム領域もあり、H3K9メチル化およびH3K27トリメチル化非依存的なヘテロクロマチン維持機構の存在が示唆される。

本研究では、H3K9メチル化を完全に欠損した細胞を確立し、H3K9メチル化とH3K27トリメチル化を欠損した細胞の状態を解析することに初めて成功しました。H3K9メチル化の欠損によるエピゲノムの変化は、生殖細胞、初期発生、老化など生体内でも生じることが知られています。

また、H3K9メチル化とH3K27トリメチル化の双方が欠損しても、一部の細胞ではヘテロクロマチンが維持されていたことから、未知のヘテロクロマチン維持機構が存在すると考えられます。

今回作製した5KO iMEFsは、動的なエピゲノムの形成基盤やヘテロクロマチンを維持するバックアップ機構の全貌の解明に有用なツールとして期待できます。

• 眞貝細胞記憶研究室
  • 主任研究員 眞貝洋一
  • 客員研究員 福田渓
  • テクニカルスタッフI 志村知古
• 平野染色体ダイナミクス研究室
  • 専任研究員 小野教夫

• • ユニットリーダー 堂前直
  • 専任技師 鈴木健裕

• 超微形態研究チーム
  • チームリーダー 米村重信
  • テクニカルスタッフI 尾上健太
  • テクニカルスタッフI 岡山聡子
• 発生エピジェネティクスチーム
  • チームリーダー 平谷伊智朗
  • 上級研究員 三浦尚

• • チームリーダー 井上梓

• • 教授 木村宏
  • 特任准教授 志見剛

• • 教授 岡田康志
  • 講師 池田一穂