DNA複製へのスイッチ、鍵は何？ 細胞増殖へ進むか止まるか、正常な細胞とがん細胞の違いを発見

大阪大学大学院生命機能研究科の林陽子特任助教（常勤）、平岡泰教授、東京工業大学 科学技術創成研究院 細胞制御工学研究センターの木村宏教授らの研究グループは、G1期の複製開始複合体MCM複合体の形成がヒストン修飾の変化によって制御されることを世界で初めて明らかにしました。

細胞が増殖するためには、DNAが複製される必要があります。DNAを複製する時期は、S期、その前の準備の期間は、G1期と呼ばれます。G1期は、細胞増殖のために複製期に進行するか、そのまま細胞周期の進行を停止するかを決める重要な時期です。MCM複合体はDNA複製を行う際にDNAのねじれを解く役割があり、S期の開始までには（つまり、G1期の終了までに）クロマチン^[用語6]上でMCM複合体の六量体単体(シングル)から六量体が2つ連結した状態(ダブル)に遷移することが知られていました。しかしながら、G1期の長い（～数十時間）ヒト細胞において、どのような過程を経てダブル六量体が形成されるのかは不明でした。

今回、ヒト細胞ではG1期に進行したばかりの初期には、MCMはシングル六量体の状態にあり、S期が始まる3～4時間前(G1期後期)になって初めてダブル六量体を形成することが分かりました（図1）。また、この変化に先行して、ヒストンH4K20^[用語7]におけるヒストンメチル化修飾^[用語8]がモノメチル化からジ・トリメチル化へ転換することが必須であることが分かりました。細胞周期の長い細胞では、MCMはシングル六量体の状態で留まることから、MCMの状態変化はDNA複製への進行過程を反映するものであり、細胞増殖の理解に繋がる重要な発見と言えます。

本研究成果は、イギリス科学誌「Nucleic Acids Research」に、11月19日（金）9時（日本時間）に公開されました。

MCMタンパク質は複製期が始まる前までにダブル六量体を形成する必要がある。G1期におけるシングル六量体からダブル六量体の変化には、ヒストンH4K20修飾のモノメチル化（me1）からジ・トリメチル化（me2・me3）への転換が必須であることがわかった。

真核生物のDNA複製は、常に複製起点と呼ばれるDNA領域から開始されます。DNA複製が開始するためには、まず複製開始複合体が複製起点に結合する必要があります。

複製開始複合体の一因子MCM（シングル六量体）は、DNAに結合しねじれを解く働きがあると知られていました。DNA複製は両方向に向かって進行することから、2セットのMCM（ダブル六量体）が必要になります。しかしながらMCMが、どのようにダブル六量体を形成するかは明らかではありませんでした。

研究グループでは、hTERT-RPE1細胞（不死化ヒト網膜色素上皮細胞）を用いて、シングルセルプロット解析法^[用語9]によりクロマチン画分に結合するMCM量が細胞周期の進行にともなってどのように変化するかを調べました（図2）。MCM量は、G1期初期では少～中程度だったのに対し、G1期後期になると多くなることが分かりました。

次に、G1期初期とG1期後期におけるMCM量の違いが何によるかを調べるために、ショ糖密度勾配法^[用語10]（図3）によって生化学的に調べました。その結果、G1期初期ではMCMはシングル六量体であり、G1期後期ではダブル六量体を形成することがわかりました。

（上段）DNAを染色するHoechst、S期のマーカーであるEdUおよびMCMに対する抗体で免疫染色^[用語11]を行った。（中段）細胞核（Hoechst）の領域内のそれぞれの輝度を測定した。（下段）横軸にHoechstをとってグラフ化した。（左）EdUの高い領域はS期（オレンジ色）、Hoechstの低いグレー領域はG1期、高いグレー領域はG2期となる。（右）縦軸をMCMで表した。左でオレンジ色のS期のものは、右でもオレンジ色で示した。MCMのG1期は値が大きく変化することが分かる。

ショ糖密度勾配法で遠心分離を行い、密度の低い物質と高い物質を分離する。MCMのシングル六量体とダブル六量体はそれぞれ異なる密度であることから、どの位置にMCMが存在するかによって、シングルかダブルかが判別できる。

細胞周期のフェーズがどの程度の長さかを複数の細胞で調べました（図4）。MCMのクロマチン結合量の多いG1期後期は3～4時間程度で、癌細胞のように増殖が盛んな細胞でも、正常細胞のように細胞周期が長い細胞でもほとんど変わりませんでした。つまり、一度クロマチンに結合するMCM量が多くなると3～4時間程度で複製期に移行することになります。一方で、MCM量が少～中程度のG1期初期は、癌細胞では7～8時間程度だったのに対し、細胞周期の長い細胞では数十時間にも及びました。この結果は、細胞周期の長さはG1期初期の長さに大きく影響を受けることを示唆していました。

G1期後期・S期・M期の長さは、癌細胞と正常細胞とでは変わらなかった。一方で細胞周期の長い正常細胞では、G1期初期の長さも長いことがわかった。

さらに、このMCMがシングル六量体からダブル六量体を形成する前に、ヒストンH4K20me1がme2/me3になることがわかりました（図5）。ヒストンH4K20me2/me3への変化を阻害すると、MCMはダブル六量体を形成できずシングル六量体で留まることから、G1期の進行においてヒストンメチル化修飾がme1からme2/me3に変化することが必須であることになります。ヒストン修飾はエピジェネティクス制御^[用語12]に関わり遺伝子発現に関与することが報告されていますが、今回の結果から遺伝子発現だけでなく細胞周期のG1期の進行にも重要な働きを持つことが分かりました。

ヒストンH4K20me1からme2/me3へ転移させるメチル基転移酵素が働くことで、MCMはシングル六量体からダブル六量体を形成する。

本研究成果により、細胞周期、G1期の進行はヒストンメチル化修飾に依存することが分かりました。ヒストン修飾はエピジェネティクス制御に関わることから、遺伝子発現制御と細胞周期との関係が注目されます。また癌細胞と正常細胞の細胞周期の長さの違いはG1期初期の状態に依ることから、癌細胞を標的とした創薬への応用も期待されます。