自然発症型糖尿病モデルマウスの作製に成功 膵臓再生医療の新しい移植モデル動物として期待

要点

• インスリン2タンパク質の104番目のアミノ酸残基を欠失
• 重度免疫不全モデルマウスBRJマウスに遺伝子変異導入
• インスリン治療により正常な血糖値に回復

概要

東京工業大学 生命理工学院 生命理工学系の粂昭苑教授、坂野大介助教、井上愛里大学院生（博士後期課程1年）らの研究グループは、熊本大学 生命資源研究・支援センターの荒木喜美教授、同大 ヒトレトロウイルス学共同研究センターの岡田誠治教授、順天堂大学大学院医学系研究科の小池正人教授らとの共同研究により、マウスのインスリン2タンパク質へのQ104del変異導入^[用語1]による自然発症型の糖尿病モデルマウスを作製した（図1）。作製した糖尿病モデルマウスは遺伝的な変異により発症するため、従来の薬剤投与による糖尿病モデルよりも安定に糖尿病を発症することができる。そして、重度免疫不全モデルマウス^[用語2]の系統に遺伝子変異を導入したため、ヒトiPS細胞やES細胞から作成された膵臓（すいぞう）細胞の糖尿病治療効果を評価するための細胞移植実験への活用が期待される。

この成果は7月22日付で英国の科学誌「Scientific Reports（サイエンティフィック・リポーツ）」にオンライン掲載された。

CRISPR/Cas9システムを用いて重篤な免疫不全BRJマウスに、変異の導入を試みた。
当初狙った相同組み換え体は得られなかったが、その代わり、遺伝子修復時に起こった3塩基DNAの欠失を有するマウス系統を得た。このゲノム配列の欠失によりインスリン2タンパク質の104番目アミノ酸であるグルタミンが失われていた。

背景

膵臓β細胞^[用語3]は血糖の恒常性維持のためにインスリンという内分泌ホルモンを産生分泌する。血糖値を感知し、インスリンを分泌する機能に関与するタンパク質群の遺伝子に変異があった場合に糖尿病を発症する。従来、インスリン遺伝子において、生後すぐに糖尿病を引き起こすことで知られている変異がいくつか報告されていたが、今回は、新生児糖尿病変異の原因となる新規なインスリン遺伝子変異としてQ104del変異を同定した。

一方で、糖尿病の治療には膵臓移植または膵臓内のランゲルハンス島^[用語4]の移植が有効な治療手段だが、ドナー不足がその妨げになっている。そこでヒトiPS細胞やES細胞を膵臓細胞へ分化させ移植源とすることが期待されている。試験管内で作製された膵臓細胞の糖尿病治療効果を評価するには糖尿病モデル動物への細胞移植を行い、血糖値の改善効果によって評価することが有効な手法である。

糖尿病モデルマウスを作製する方法としては、薬剤を使ってβ細胞を破壊する方法がよく使用されているが、遺伝子変異糖尿病モデルの方が安定した高血糖状態を作り出せると考えた。従来からよく使われている自然発症糖尿病モデルマウスは重篤な免疫不全の系統ではないため、ヒトの細胞の移植後の生着率を上げる必要があった。そこで従来のモデルマウスと比べてさらに重篤な免疫不全モデルであるBRJマウス^[用語5]のインスリン遺伝子に変異を導入した重度免疫不全糖尿病モデルを作製することにした。

研究成果

粂教授と荒木教授らは当初、ゲノム編集技術の一つであるCRISPR / Cas9システム^[用語6]を使用して重度免疫不全マウスであるBRJマウスのInsulin2遺伝子^[用語7]を編集し、得られたマウスのなかにインスリン2タンパク質の104番目のアミノ酸であるグルタミンが欠失したマウスを得た。このマウスは糖尿病の症状を示したことから、この変異型をKuma変異と名付けた。Kuma変異をもつマウス（Kumaマウス）は、生後4週以降に血糖値が上昇した（図2）。

野生型マウスとKumaヘテロ接合体の各週齢におけるオスの随時血糖。野生型マウスの血糖値は、100～200 mg/dL程度であるが、Kumaマウスでは、3週齢ごろより血糖上昇が確認された。
§p < 0.05, §§p < 0.01

得られたKumaマウスの解析により、変異インスリンタンパク質の安定性が低く、生後3週以降にKumaマウスの膵臓β細胞におけるインスリンタンパク質の産生量が減少していたことが分かった。そして、小池教授らの電子顕微鏡観察結果により、生後3週以降では、Kumaマウスの膵臓β細胞内のインスリン顆粒の数が減少していることが分かった（図3）。

5週齢オスマウスの膵臓の電子顕微鏡観察像。Kumaマウスにおいて、成熟したインスリン顆粒（黒矢頭）の数が少なくなっていた。

さらに成長とともに膵臓内のβ細胞が減少していく様子も観察された。これらの表現型の変化に伴って、インスリンの分泌する能力は失われていくが、インスリンを徐々に放出するチップをマウス体内に入れ、インスリンを投与することで高血糖を是正できることを確認した（図4）。

メスのKumaヘテロ接合体マウスにインスリン徐放チップを投与した。インスリン投与前後の血糖値を測定した。インスリン投与は8週齢から12週齢にかけて、4週間行った 。インスリン投与により、通常血糖（200 mg/dL以下）まで高血糖は低下し、インスリン投与を停止する（チップの除去）と再び高血糖となった。

これらの結果から、インスリンを分泌するiPS細胞由来の膵臓細胞を移植し、糖尿病の治療効果を評価する動物モデルとしてこのKumaマウスが有用であることが明らかになった。

今後の展開

ヒトiPS細胞から血糖値に応じてインスリンを分泌できる膵臓細胞（iPS-β細胞）を高効率に作り出すことが、世界的に可能になりつつある。今後、これらのiPS-β細胞を再生医療に利用し、長期間の治療効果を発揮できるかどうかを判断するためKumaマウスへの細胞移植実験を進めることにしている。

論文情報

掲載誌 :	Scientific Reports
論文タイトル :	Insulin2Q104del (Kuma) Mutant Mice Develop Diabetes with Dominant Inheritance
著者 :	Daisuke Sakano, Airi Inoue, Takayuki Enomoto, Mai Imasaka, Seiji Okada, Mutsumi Yokota, Masato Koike, Kimi Araki, Shoen Kume
DOI :	10.1038/s41598-020-68987-z

• プレスリリース 自然発症型糖尿病モデルマウスの作製に成功 ―膵臓再生医療の新しい移植モデル動物として期待―
• iPS細胞由来インスリン産生細胞におけるオープンイノベーション研究を開始｜東工大ニュース
• 生命理工学の面白さを語る～動画「生命の真理を探り、新たなものを作り出す」～｜東工大ニュース
• 顔 東工大の研究者たち Vol. 37 粂昭苑｜研究ストーリー
• 粂・白木研究室
• 研究者詳細情報（STAR Search） - 粂昭苑 Shoen Kume
• 研究者詳細情報（STAR Search） - 坂野大介 Daisuke Sakano
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• 熊本大学 生命資源研究・支援センター
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