培養神経細胞の均一性を担保し、神経細胞の分化を安定的に促進させる手法を開発

立体的な微細溝加工を施したナノシートを培養基材として利用。
薬剤開発時の実験の再現性向上や移植医療への応用に期待

東京工業大学 生命理工学院 生命理工学系の藤枝俊宣講師、東海大学 医学部医学科基礎医学系分子生命科学の大友麻子助教、同中川草講師、上田真保子奨励研究員、工学部応用化学科の岡村陽介教授（共に東海大学マイクロ・ナノ研究開発センター兼任）、早稲田大学 理工学術院の武岡真司教授の共同研究グループでは、立体的な微細溝加工を施した高分子超薄膜（ナノシート）^[用語1]を培養基材^[用語2]として用いることで、培養神経細胞^[用語3] の均一性を担保するとともに、神経細胞の分化^[用語4]が促進されることを見い出しました。

なお、本研究成果は2020年4月21日（火）、国際学術誌『Scientific Reports』（DOI: 10.1038/s41598-020-63537-z ）に掲載されました。

要点

• アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患の罹患者が増加
• 基礎研究や薬剤開発の過程において、培養神経細胞の不均一性が実験の再現性を阻害
• 立体的な微細溝（溝幅: 50 μm）を加工した高分子超薄膜（ナノシート）（膜厚: 150 nm）を培養基材として用いることで、神経細胞の分化が促進され、培養神経細胞の均一性が保たれることを発見
• 今後は、培養基材の立体的特性やナノシートの物性が神経細胞の分化や成熟に与える影響について、分子レベルで解析を展開
• ナノシートの技術やマイクロデバイス技術を組み合わせた種々の立体的な培養基材を用いることによって、生体内に存在する神経細胞の立体的な環境の再現を目指す。

背景

超高齢社会を迎え、加齢に伴って発症リスクが増加するアルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患の罹患者が増加しています。これらの疾患に対する基礎研究や薬剤開発の過程では、必ず培養神経細胞が用いられます。しかし、培養神経細胞は実験ごとにその分化状態にばらつきが出やすいため、均一な条件下での研究および薬剤スクリーニングなどの実施を担保できない場合があります。そのような培養神経細胞の不均一性を改善し、実験の再現性を高めることが課題となっていました。

概要

本研究では、ポリ乳酸（PLA）を用いて作製した平滑なナノシートと、立体的な微細溝加工（溝幅: 50 μm）を施したナノシートを、それぞれ培養基材として用いてマウスの大脳皮質由来の神経細胞を培養しました。1ナノメートルは一万分の一ミリメートルです。今回は膜厚150 nmのナノシートを用いました。（図1）

平滑および立体的溝加工ナノシート基材上の神経細胞の分布を示す。平滑ナノシート上では細胞がランダムに接着するが、立体的な微細溝加工を施したナノシート上では溝構造が細胞接着部位を制御する。

微細溝加工したナノシートを神経細胞の培養基材として用いた場合の成長・分化などに与える影響を調べるために、蛍光顕微鏡や次世代シークエンサー^[用語5]などを活用して細胞形態の解析と遺伝子発現解析を行いました。

その結果、微細溝加工ナノシートを用いて神経細胞を培養すると、神経突起の進展方向が一定方向に制御され（図2）、シナプス形成に関わる遺伝子群の発現が早まることが示されました。

マウス由来大脳皮質初代神経培養細胞（培養後9日目）の神経細胞の染色像を示す。緑（Tuj-1）は神経突起、赤（MAP2）は 樹状突起、青（DAPI）は 核染色を示す。Mergeはそれらの重ね合わせた画像を示す。図中の白両矢印は微細溝加工の方向を示す。微細溝加工したナノシートを用いて神経細胞を培養すると、神経突起の進展方向が一定方向に制御されていた。
Otomo and Ueda et al., Scientific Reports, in press.

また、微細溝加工したナノシートを用いて培養した神経細胞は、平滑なナノシートと比較して、遺伝子発現パターンが均一化していました。これは、微細溝加工したナノシートが神経細胞の安定的な分化誘導に寄与する可能性があることを示唆しています。（図3）

網羅的遺伝子発現解析を用いて主成分分析を行った結果を示す。微細溝加工したナノシートを用いて培養した神経細胞は、平滑なナノシートと比較して、遺伝子発現パターンが均一化していた。
Otomo and Ueda et al., Scientific Reports, in press.

研究成果

培養基材の形態が神経細胞の形態形成や遺伝子発現パターンに影響を与えることはこれまでにわかっていましたが、神経細胞の分化に関して詳細な解析はなされていませんでした。本研究を通じて、培養基材に立体的な微細溝加工を施すことで、神経細胞の分化を促進し培養神経細胞の均一性を担保することが明らかとなりました。これにより、実験の再現性を高める効果があると考えられます。また、今回培養基材として用いたPLAナノシートは柔らかく、厚さも50-100 nm程度と薄いため、種々の加工が可能です。本研究の結果により、立体的な微細溝加工を持つPLAナノシートが、神経細胞の培養基材として優れていることが示されました。

今後の展望と課題

本研究により、立体的な微細溝加工を持つナノシートが、神経細胞の培養基材として優れていることが明らかになりました。一方、培養基材の立体的特性が培養神経細胞に与える影響や、ナノシートの物性が培養神経細胞に与える影響について明らかにすることはできませんでした。今後、培養基材の立体的特性やナノシートの物性が神経細胞の分化や成熟に与える影響について分子レベルで解析していきます。また、生体内に存在する神経細胞は、周囲を様々な細胞に取り囲まれた立体的な環境で生存しています。これらの環境をナノシートの技術やマイクロデバイス技術を組み合わせた種々の立体的な培養基材を用いることによって再現し、再生医療や移植医療に用いる神経細胞培養基材を開発することを目指します。

論文情報

掲載誌 :	Scientific Reports
論文タイトル :	Efficient differentiation and polarization of primary cultured neurons on poly (lactic acid) scaffolds with microgrooved structures
著者 :	Asako Otomo, Mahoko Takahashi Ueda, Toshinori Fujie, Arihiro Hasebe, Yoshitaka Suematsu, Yosuke Okamura, Shinji Takeoka, Shinji Hadano & So Nakagawa
DOI :	10.1038/s41598-020-63537-z

• プレスリリース 培養神経細胞の均一性を担保し、神経細胞の分化を安定的に促進させる手法を開発―立体的な微細溝加工を施したナノシートを培養基材として利用。薬剤開発時の実験の再現性向上や移植医療への応用に期待―
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